氮吹儀在測定保健酒中總皂苷含量

  保健酒（Liqueurs）是由基酒加中藥配制而成，具有抗疲勞，調(diào)節(jié)免疫力之功效。保健酒將中藥功能與酒的作用有效結(jié)合，極大地增強(qiáng)了藥物的效能與作用，藥借酒勢，酒助藥威，迅速增強(qiáng)人體微循環(huán)（擴(kuò)張毛細(xì)血管），使有效成分直達(dá)病灶，諸多癥狀可迅速得到緩解或消失。保健酒的生物活性成分通常來自傳統(tǒng)中藥，特別是有滋補(bǔ)作用的中藥。總皂苷即為保健酒中重要的功效成分，“皂苷”是由甾體或三萜類化合物作為苷元與糖分子縮合而成的一類低聚糖苷，是一類廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)化合物，它具有調(diào)節(jié)腎臟功能，抗缺氧和抗疲勞、抗低溫應(yīng)激作用、抗脂質(zhì)氧化作用、抗致突變作用及雙向調(diào)節(jié)免疫的保健功能。總皂苷的現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)為2003 版《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，該法是針對(duì)保健食品中“總皂苷”含量測定的一個(gè)廣泛方法。皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基本身可與香草醛發(fā)生顯色反應(yīng)，保健酒中含有多種不同糖基數(shù)的皂苷致使與香草醛出現(xiàn)顯色結(jié)果差異。為消除糖基對(duì)香草醛顯色劑的干擾，本研究在衛(wèi)生部方法的基礎(chǔ)上將保健酒中皂苷水解成不含有糖基的苷元再與硫酸-香草醛顯色，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測保健酒樣中總皂苷含量的目的。

材料與方法

材料、儀器及試劑

  供試品與對(duì)照品：保健酒A，海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司提供；人參皂苷Re，中國藥品生物制品檢定所。

  儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)；十萬分之一分析天平；萬分之一天平；漩渦混懸器；固相萃取儀；隔膜真空泵；氮吹儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。移液槍；塑料離心管；50 mL圓底燒瓶；巴氏吸管；固相萃取柱(bond Elut-C18 OH，500 mg 3 mL，50/PK，Agilent Technologies)。試劑耗材：香草醛（基準(zhǔn)試劑）二氯甲烷、甲醇、乙腈、硫酸、鹽酸為分析純；77 %硫酸溶液（v/v）；lv化氫水溶液（4 mol/L）；70 %甲醇水溶液（v/v）。香蘭素硫酸顯色中間液：準(zhǔn)確吸取8 %香蘭素甲醇溶液500 μL 加入3000 μL 的77 %硫酸溶液中，振蕩混合均勻，冷卻至室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用。

實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)照品溶液的制備

皂苷苷元溶液的制備

  精密稱取人參皂苷Re 適量，用甲醇定容，配制成人參皂苷Re 對(duì)照品溶液（4 mg/mL），精密移取500 μL 的乙腈于塑料離心管中，加入鹽酸（4 mol/L）500 μL，渦旋混勻得到水解溶劑，再往其中加入4 mg/L 的Re 對(duì)照品溶液1 mL，渦旋混勻后放入80 ℃恒溫水浴3 h，冷卻后加入5 mL 的二氯甲烷和3 mL的去離子水，有機(jī)相用3 mL水洗兩遍，分離去掉水層(上層)。二氯甲烷有機(jī)相層經(jīng)氮吹儀吹干，用2 mL 乙腈溶解，得到濃度為1.0 mg/mL 的人參皂苷苷元溶液。

苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液

  分別準(zhǔn)確吸取苷元溶液（1.0 mg/mL）75 μL、150 μL、300 μL、600 μL 于刻度試管中，用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，得到濃度為0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.30 mg/mL、0.60 mg/mL 的苷元標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

顯色

  分別準(zhǔn)確吸取濃度為0.075 mg/ mL、0.15 mg/ mL、0.30 mg/ mL、0.60 mg/ mL的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液500.0 μL加入到4.5 mL的香草醛硫酸顯色中間溶液中，渦旋混勻，同時(shí)吸取500.0 μL的乙腈按照上述步驟操作，得到溶劑空白顯色組。所得混合物于70 ℃水浴加熱10 min 后迅速放入冰水中冷卻30 s，檢測溶液在541 nm（掃描大吸收波長）波長下的吸光度, 每個(gè)樣品平行測定3 次。

供試品溶液的制備

皂苷提取

  準(zhǔn)確吸取1.0 mL 保健酒A于瓷蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇和水，所得固體用1.0 mL 水溶解，備用。將此樣品溶液加入經(jīng)激活的萃取小柱中，然后用6 mL去離子水洗滌，保持1～2 滴/s 的速度除去樣品中的糖類物質(zhì)。再分別用70 %甲醇水溶液（6 mL）和甲醇(10 mL)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去甲醇和水，所得固體用甲醇1.0 mL溶解備用。

水解

  精密移取500 μL 的乙腈于15 mL 塑料離心管中，加入鹽酸500 μL，渦旋混勻得到水解溶劑，加入上述酒樣甲醇溶液1 mL，渦旋混勻后放入80 ℃恒溫水浴3 h，冷卻至室溫后加入5 mL 的二氯甲烷和3 mL的去離子水，有機(jī)相用3 mL水洗兩遍，分離去掉水層(上層)。二氯甲烷有機(jī)相層經(jīng)氮吹儀吹干，用2 mL乙腈溶解得到酒樣水解的苷元溶液。

顯色

  分別準(zhǔn)確吸取500.0 μL酒樣苷元乙腈溶液加入到4.5 mL 的香草醛-硫酸顯色中間溶液中，混合均勻，所得混合物于70 ℃水浴中加熱10 min 后，迅速放入冰水中冷卻30 s，上機(jī)測定吸光度，每個(gè)樣品平行測定2 次。

討論

  本實(shí)驗(yàn)將保健酒A中的皂苷水解成苷元，消除了糖基對(duì)香草醛顯色劑的干擾，采用液液萃取方式提取苷元的同時(shí)除去了酒樣中的干擾色素。實(shí)驗(yàn)采用皂苷酸水解顯色法測定保健酒A中的總皂苷含量，以水解后的人參皂苷苷元制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。此改良法具有范圍線性良好、準(zhǔn)確度高、度好、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合用于保健酒中總皂苷含量的定量分析和質(zhì)量控制。